研究手法

HuPEX®網羅型タンパク質アレイ解析

アレイ解析に使用したサンプルは、ROHHAD症候群の小児患者5名（女性4名、男性1名）の血清を混合したミクスチャー血清。
その結果、33種類のタンパク質が自己抗体の候補抗原としてリストアップされました。

カスタムアレイの作製と自己抗体解析

マーカー候補となる33種類の抗原タンパク質を用いて、カスタム型タンパク質アレイを作製しました。アレイ解析に使用したサンプルは、非がんROHHAD症候群患者5名の血清。患者5名の内4名でZSCAN1タンパク質に反応する自己抗体が検出されました。

患者血清IgGおよび抗ZSCAN1抗体（市販）の組織染色

患者血清IgGおよび抗ZSCAN1抗体（市販）を用いたマウス脳下垂体外器官の組織染色を実施しました。 脳弓下器官内にZSCAN1タンパク質が発現しており、患者血清中の自己抗体が同一部位と反応することを確認しました。
ZSCAN1がROHHAD症候群の自己抗体標的であることが判明しました。

抗ZSCAN1抗体を検出するELISA法の開発

ROHHAD症候群で非がんROHHAD症候群患者14名、正常な被験者15名、および自己免疫疾患を持つ被験者5名を対象に、抗ZSCAN1抗体の陽性反応をELISA法を用いて解析しました。
腫瘍の有無にかかわらず、抗ZSCAN1抗体がROHHAD症候群の診断マーカーとして有用である可能性が示唆されました。

成果

• 腫瘍の有無にかかわらず、抗ZSCAN1抗体がROHHAD症候群の診断マーカーとして有用である可能性が示唆されました。

論文情報
Akari Nakamura-Utsunomiya , et al. Anti-ZSCAN1 Autoantibodies Are a Feasible Diagnostic Marker for ROHHAD Syndrome Not Associated with a Tumor
Int J Mol Sci. 2024 Feb 1;25(3):1794. doi: 10.3390/ijms25031794.

研究手法

HuPEX®網羅型タンパク質アレイによる自己抗体プロファイリング

遺伝子12,946クローンから合成した抗原タンパク質が搭載されたHuPEX®網羅型タンパク質アレイを用いて、全身性強皮症（SSc）患者検体（N=32）、尋常性乾癬（PsO）患者検体（N=8）、皮膚動脈炎（CA）患者検体（N=16）、悪性黒色腫（N=40）、健常者（N=20）のプール血清から自己抗体を測定しました。

自己抗体の絞り込みと相関解析

SSc、PsO、CAにおいてプロテオーム全体にわたる自己抗体プロファイリングを実施した結果、合計565種類の自己抗体を検出しました。診断や疾患活動性マーカーとして報告のある自己抗体と、細胞膜や細胞外に発現するタンパク質に対する自己抗体、合計178種類に絞り込み、臨床所見と詳細な解析を行いました。

各疾患の臨床的特徴と自己抗体レベルの関連

炎症マーカーであるC反応性タンパク質（CRP）と正の相関を持つ自己抗体の総和（SAL-P-CRP）を求めて、各疾患との臨床的特徴を解析しました。SSc患者において、SAL-P-CRPは、間質性肺疾患（ILD）の指標や皮膚硬化スコア（mRSS）と有意に相関し、ILD予測において既存マーカーよりも優れていることが示されました。PsO患者では、SAL-P-CRPは乾癬性関節炎（PsA）を有する患者で有意に高く、皮膚症状（PASIスコア）とも関連しました。CA患者では、SAL-P-CRPは治療非反応性の患者で有意に高値を示しました。

悪性黒色腫における自己抗体の網羅的な測定の臨床的意義

MM患者血清から488種類の自己抗体を検出しました。転移のある進行型MM患者（StageⅢ, Ⅳ）では、転移のないMM患者（StageⅠ, Ⅱ）よりも自己抗体の産生が顕著であることが判明しました。以上の結果は、MM患者における網羅的な自己抗体同定によって、転移や進行が予測できる可能性を示しています。

成果

• 間質性肺疾患を予測する自己抗体としては、抗トポイソメラーゼＩ抗体がこれまで最も有用 (70％以上で、間質性肺疾患を予測)でした。
• CRPと有意な正の相関を示した自己抗体の力価の総和 (SAL-P-CRP) は、抗トポイソメラーゼＩ抗体より有用な強皮症の重症度を反映する新たなバイオマーカーとなる可能性が示されました。
• プロテオーム全体にわたる自己抗体の網羅的なスクリーニングにより、疾患特異的な免疫学的特徴を明らかにし、新しい診断ツールの開発への道を開く可能性があります。

論文情報
Kazuki M Matsuda, et al. Autoantibody Landscape Revealed by Wet Protein Array: Sum of Autoantibody Levels Reflects Disease Status
Front Immunol. 2022 May 4:13:893086. doi: 10.3389/fimmu.2022.893086.

研究手法

タンパク質の合成

全身性自己免疫疾患のなかで全身性強皮症（SSc）および多発性筋炎/皮膚筋炎（PM/DM）に関連する43種類の自己抗体を検出するため、65抗原タンパク質を選出しました。

カスタム型アレイの作製

選出された65種類の抗原タンパク質を搭載した、カスタム型タンパク質アレイを作製。 使用した血清は、日本人の全身性強皮症（SSc）患者357名、多発性筋炎/皮膚筋炎（PM/DM）患者172名、日本人の健常者93名。

自己抗体検出と解析

SSc患者、PM/DM患者、健常者の血清をカスタム型アレイで解析した結果、SSc患者では抗CENP-B抗体（32.2%）、抗トポイソメラーゼI抗体（26.9%）、抗RNAポリメラーゼⅢ抗体（11.2%）が上位で検出されました。PM/DM患者では抗TIF1-γ抗体（24.4%）、抗TIF1-α抗体（18.0%）、抗PL-7抗体（6.4%）が上位に検出されました。また、両疾患に関連する抗SS-A/Ro52抗体はSSc患者の25.2%、PM/DM患者の36.0%で検出されました。一方、健常者ではほとんどの自己抗体が検出されませんでした。

補助検証

市販ELISAキットを用いて、抗トポイソメラーゼI抗体、抗CENP-B抗体、抗RNAポリメラーゼⅢ抗体などの自己抗体レベルを測定し、抗AMA-M2抗体を市販FEIAキットで測定しました。免疫沈降法で抗体を検出し、間接蛍光抗体法による細胞染色で自己抗体の蛍光パターンを観察しました。Spearman相関検定を使用した相関解析を実施しました。

成果

• カスタム型アレイでは、一度の検査で43種類の自己抗体を検出可能でした。この研究は、カスタム型アレイの有用性を示すとともに、包括的な自己抗体プロファイリングにより、診断精度の向上、早期診断、個別化治療、予後予測が可能になり、患者に合わせた最適な医療を提供する基盤が構築されました。また、疾患理解の深化と新規治療法開発にも寄与する重要なデータが得られました。

論文情報
Ai Kuzumi, et al. Comprehensive autoantibody profiling in systemic autoimmunity by a highly-sensitive multiplex protein array
Front Immunol. 2023 Aug 28:14:1255540. doi: 10.3389/fimmu.2023.1255540. 

研究手法

タンパク質アレイの開発

ヒトcDNAを鋳型として合成した19,446個のタンパク質を搭載したウェットな網羅型タンパク質アレイ（CWPA）を開発しました。CWPAは世界最大規模のタンパク質搭載数と、作製からアッセイまで一貫して乾燥を防ぐ特徴をもちます。またタンパク質搭載量の高い均一性（最も搭載量が多いタンパク質と少ないタンパク質の差が平均47.3倍以内に収まっている）も実現しました。

網羅型タンパク質アレイを使用したmAb TRA98抗原の同定

マウスモノクローナル抗体 TRA98 (mAb TRA98)は生殖細胞核を特異的に認識する特徴をもち、生殖細胞研究で多く用いられてきましたがその抗原は20年以上不明でした。今回CWPAを用いmAb TRA98が認識するヒト抗原の同定を行ったところ、mAb TRA98はnuclear factor-κB activating protein (NKAP)タンパク質に特異的な結合を示しました。

Nkap遺伝子の機能欠損マウスによる表現型観察

生殖細胞におけるNKAPタンパク質の役割を探るため、精巣のNkap遺伝子をノックアウトしたマウス（Cre/loxP系条件欠損マウス）を作成しました。その結果、野生型マウスとは異なり、精巣は未成熟で生殖細胞が欠失しているセルトリ細胞遺残症候群の病態を呈しました。

NKAPは精巣でSUMO化される

FLAGタグ融合NKAPを導入したトランスジェニックマウスの精巣では、抗FLAG抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、分子量98 kDaのタンパク質として検出されました。FLAGタグ融合NKAPタンパク質の分子量は47 kDaであることから、精巣ではタンパク質が修飾されていることが予想されました。このタンパク質修飾はSUMO化であることが示唆されました。

成果

• タンパク質搭載量の均一性が高いCWPAを用いることで、TRA98がヒトにおいて認識する抗原はNKAPであることが明らかになりました。
• 精巣のNKAPはSUMO化されており、分子量は98 ｋDaでした。
• NKAPは精巣の成熟のため重要な働きをもつことが明らかになりました。

論文情報
Eriko Fukuda, et al. Identification and characterization of the antigen recognized by the germ cell mAb TRA98 using a human comprehensive wet protein array
Genes Cells. 2021 Mar;26(3):180-189. doi: 10.1111/gtc.12832.

研究手法

特発性間質性肺炎(IIP)における自己抗体スクリーニング

特発性間質性肺炎と診断された患者295人を対象として、35S-メチオニン標識タンパク質免疫沈降法を使用して自己抗体スクリーニングを行いました。
その結果、IIP患者295人のうち6人の患者血清において、共通の4量体タンパク質を免疫沈降する結果を得ました。
この4量体の中の抗原を同定するためにHuPEX®網羅型タンパク質アレイを用いて解析したところ、インターフェロンガンマ誘導性タンパク質16（IFI16タンパク質）が同定されました。

インターフェロンγ誘導性タンパク質16 (IFI16)のタンパク質合成と抗原-抗体反応の確認

4量体タンパク質に対する自己抗体がIFI16タンパク質を特異的に認識することを確認するために、IFI16のCDS(coding sequence)を導入したプラスミドを用いたin vitro transcription-translation (IVTT)によりIFI16蛋白を合成し、免疫沈降法を行った結果、4量体タンパク質に反応した6例の患者血清すべてにおいてIFI16の沈降が確認され、IFI16が目的の対応抗原であることが確認されました。

抗IFI16抗体に関連する臨床的特徴

IIP患者の中でこの抗IFI16抗体が検出される患者は免疫抑制療法を受ける機会が少なく、予後が悪い可能性があります。患者の層別化と管理を改善するために、さらなる研究が必要です。

成果

• IIPにおける新規自己抗体マーカー、抗IFI16抗体を発見しました。この自己抗体の抗原同定にはHuPEX®網羅型タンパク質アレイが使用されました。
• 抗IFI16抗体の臨床的意義を明らかにする研究は、治療反応性の予測、個別化治療の可能性、疾患の免疫学的背景の理解を深めることにつながり、より適切な治療法の開発に寄与する可能性があります。

論文情報
Tsuneo Sasai, Ran Nakashima, et al. Anti-interferon gamma-inducible protein 16 antibodies: Identification of anovel autoantigen in idiopathic interstitial pneumonia and its clinicalcharacteristics based on a multicenter cohort study
Clin Immunol. 2024 Nov:268:110372. doi: 10.1016/j.clim.2024.110372.

研究手法

タンパク質発現

全身性強皮症（SSc）の患者血清中の自己抗体解析を目的として、RNAポリメラーゼⅢ（RNAPⅢ）複合体のサブユニットおよびRNAPⅢ主要抗原RPC1の部分タンパク質を合成しました。17種類のRNAPⅢ複合体サブユニットの全長タンパク質と、5種類のRPC1の部分タンパク質を、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を使用してFLAG-GST融合タンパク質として合成しました。

抗原結合プレートの作製

合成したタンパク質を使用して、プロテオブリッジ社独自の技術である抗原結合プレートを作製しました。抗原結合プレート（96ウェルプレート）は、各ウェルがグルタチオン（GSH）でコーティングされており、FLAG-GST融合タンパク質を結合させることができます。

自己抗体の検出・定量

抗RNAポリメラーゼⅢ抗体（ARA）陽性SSc患者34名を含むSSc患者75名の血清サンプルを用いて、RNAPⅢ複合体のサブユニット17種類と主要抗原RPC1の部分タンパク質5種類に対する自己抗体の測定を行いました。
その結果、ARA陽性のSSc患者において、RNAPⅢ複合体の様々なサブユニットに対する自己抗体が検出され、患者ごとに異なるパターンを示しました。
そこで、RNAPⅢ複合体のサブユニットに対する分子間のエピトープの広がりと、主要エピトープRPC1に対する分子内のエピトープの広がりを定量化し、比較検証を行いました。

統計解析・臨床像との相関

定量化したRNAPⅢ複合体のサブユニットと主要エピトープRPC1に対するエピトープの広がりと臨床所見との関連を解析しました。興味深いことに、サブユニットへのエピトープの広がりが大きいほど、皮膚硬化（mRSS）とSP-D（間質性肺炎マーカー）に対してSpearmanの相関係数において有意な相関を認めました。
また、主要エピトープRPC1へのエピトープの広がりが大きいほど、腎クリーゼの発症リスクが高いことがわかりました。
同一患者において経時的にエピトープの広がりを評価すると、皮膚硬化の程度と連動していることがわかり、SScにおける疾患活動性のマーカーとして有用であることが示唆されました。

成果

• RNAPⅢ複合体のサブユニットをターゲットにした抗体がSSc患者における疾患の重症度や臓器障害（皮膚や肺）と相関していることを示し、これらの抗体が早期診断や予後評価のための有力なバイオマーカーとなる可能性を示唆しています。
  ※エピトープスプレッディング（ES）とは、自己免疫疾患において、最初に特定の抗原に対する自己抗体が形成された後、異なる抗原に対しても自己抗体が次第に形成される現象を指します。

論文情報
Hirohito Kotani et al. Diversity and Epitope Spreading of Anti-RNA Polymerase III Antibodies in Systemic Sclerosis: A Potential Biomarker for Skin and Lung Involvement
Arthritis & Rheumatology, 2024. doi: 10.1002/art.42975

受託解析のご依頼は、以下の流れとなります。まずはお見積りフォームより、ご連絡ください。

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検査可能です。 ただし時間が経過した検体では、遠心処理で沈殿物が発生する傾向がございます。検体アッセイの前処理（遠心処理）によって、血清・血漿から200µL以上の上清が得られなかった際にはご相談させていただきます。

ご依頼の際に検査依頼書にてご連絡いただけましたら返却可能です。

お送りいただきましたサンプルは、ご依頼時にお客様からの返却希望のお申し出がない場合、原則、解析終了後に破棄させていただきます。

以下の場合、解析をお受けできない場合がございます。詳しくは、検査説明書の免責事項をご確認ください。

• 検体が最低容量（300µL）に満たない場合
• 輸送時のトラブルで、検体の温度管理に不備があると判断される場合
• 検体にBSL3以上の病原性に関する感染リスクがあると判断される場合
• 適切なインフォームドコンセントが取得されていないことが疑われる場合
• その他検体の量又は質に関する状態により当社が検査は実施できないと判断した場合

検体到着後、原則2か月で報告いたします。ただし、繁忙期は納期が遅くなることがありますので、ご了承ください。

解析結果について、結果レポート(pdf)と各搭載遺伝子タンパク質に対する定量データ(Excel)をDropboxでのデータ転送あるいは、CD-Rにて納品させていただきます。納品物には、以下のファイルが収録されています。

• 「作業完了報告書（結果報告書）」ファイル（PDF形式）：解析の要約、実験概要、データ解析、結果等を記載したレポートです。
• 「定量データ」ファイル（Excel形式）：アッセイ後の蛍光画像から得られた各搭載遺伝子タンパク質に対するシグナルの定量データを収録しています。

個別に対応させていただきます。 当社衛生検査センター（）もしくは報告書に記載の連絡先までお問い合わせください。

大変申し訳ございませんが結果の解釈については、当社ではお受けできかねます。 解析結果の解釈につきましては、お客様ご自身で行っていただきたく存じます。

以下の場合、解析結果が得られない場合がございます。 詳しくは、検査説明書の免責事項をご確認ください。

• 検体中にコムギ蛋白質に対する抗体が含まれている場合
• 検体中にFLAG+GST(Glutathione S-Transferase)タグに対する抗体が含まれている場合
• その他検体由来の要因によって、バックグラウンドの値が異常であると判断された場合

アレイに搭載されている抗原タンパク質は、タンパク質合成からアッセイまで非乾燥を保持しており、生体内に近い状態で免疫反応や薬の反応性を測定することができます。詳しくは「タンパク質アレイの特徴 ～他のタンパク質アレイとの違い～」をご覧ください。

「搭載タンパク質の遺伝子名・機能」からリストがご覧いただけます。

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